饮用水砂滤池中微生物对微量污染物的降解潜力与途径
2025-09-26 13:51:44 欧冠世界杯
砂滤池在世界范围内广泛应用于饮用水处理中.最初对砂滤池净水原理的认识仅限于物理过滤作用, 认为滤料的孔隙能有效截留源水中的微生物和部分化学污染物, 并且滤料自身具有的吸附能力能有效促进污染物的去除[1].近些年来的研究表明截留的微生物在贫营养且间断性水力冲击的条件下能缓慢生长, 并在滤料表面形成一层生物膜, 而这层生物膜可以去除氨氮和有机物, 且能调控滤池出水中的微生物物种组成[2, 3].
有研究证明, 砂滤池能去除多种难降解的微量污染物[4~9].如在空床接触时间为0~60 h范围内时, 慢速生物砂滤池对7种微量污染物(双氯芬酸、普萘洛尔、碘普罗明、碘己醇、碘美普罗、戊康唑和丙环唑)的去除规律符合一级动力学[4].Zearley等[5]的研究发现, 快速砂滤池对19种微量污染物如咖啡因、阿特拉津、卡马西平、萘普生和甲氧苄啶等的去除也遵循一级动力学方程.研究在模拟生物滤池反应器中投加29种微量污染物, 发现其中有11种可以被生物去除, 包括阿替洛尔、咖啡因和萘普生等, 而卡马西平、阿特拉津和磺胺甲唑等13种物质在生物滤池中具有抗性, 难以被生物去除[6].在以地下水为水源的快速砂滤池中, 氯丙酸在滤池吸附和微生物的共同作用下由0.037μg·L-1降至 < 0.010 μg·L-1[7]; 除草剂苯达松在初始浓度较低时(< 10 μg·L-1)去除率高达92%, 其生物转化作用与甲烷氧化菌和异养菌的活性有关, 降解产物为羧基苯达松[8].此外, 有研究还发现在滤池中加入Aminobacter sp. MSH1菌株, 能强化去除地下水中2, 6-二氯苯甲酰胺, 并将2, 6-二氯苯甲酰胺矿化为CO2、NH4+和Cl-[9].
尽管以往研究表明微生物是砂滤池去除微量污染物的一个关键部分, 但: ①何为微生物对微量污染物的降解途径？②其具体的降解微生物有哪些？仍不清楚.为回答以上科学问题, 本研究结合液相质谱分析和宏基因组学技术, 解析了砂滤池微生物对典型微量污染物的潜在去除机制, 通过明确砂滤池中微生物在微量污染物去除中的作用, 加深了人们对饮用水砂滤池净水作用的基础认知.
1 材料与方法
1.1 微量污染物降解数据库的构建
根据已有报道和enviPath[10]数据库确定微生物对4种目标微量污染物的降解基因(酶).进一步在GenBank、KEGG和Swiss-Prot这3个数据库中下载相关的DNA序列和蛋白序列, 整合为一个目标微量污染物微生物降解基因(酶)参考数据库.
1.2 滤料采集和宏基因组分析
本研究以江苏刘湾净水厂和内蒙古通新净水厂的砂滤池为研究对象.江苏刘湾净水厂以地表水为水源, 砂滤池采用石英砂滤料, 内蒙古通新净水厂以地下水为水源, 砂滤池采用锰砂滤料.为保证足够的生物量, 在砂滤池反冲洗前采集滤料并低温保存运回实验室.使用土壤DNA提取试剂盒(DNeasy PowerMax Soil Kit, QIAGEN, Germany)提取滤料中的DNA并委托华大基因进行宏基因组测序, 序列去除污染后进行以下生物信息学分析.
(1) 组装和分箱利用MEGAHIT (v1.1.3)将4个样本(2个石英砂滤料和2个锰砂滤料)宏基因组短序列[(4.96±0.09) Gbp]进行组装.使用MetaBAT[11]、CONCOCT[12]和MaxBin[13]分别将组装序列聚类得到宏基因组草图(metagenome-assembled genomes, MAGs).锰砂和石英砂滤池的DNA序列使用上述软件进行单个样本组装和所有样本混合组装并生成微生物基因组草图, 使用MetaWRAP中的bin_refine模块对每个样品的MAGs进行筛选[14] (完整性>50%; 污染率 < 10%), 获得高质量的MAGs.然后将所有样品MAGs合并并用dRep[15]去冗余(完整性>50%; 污染率 < 10%), 最终形成一个非冗余的基因组集.
(2) 使用基因组分类数据库(gtdbtk.r86_v3_data.tar.gz)对非冗余基因组MAGs进行注释, 非冗余基因组集在每个样本中的相对丰度的计算方法参考前人的研究[BBMap(v38.43)][16].采用SingleMv0.13.2(https://github.com/wwood/singlem)评估MAGs的群落代表度.
1.3 含微量污染物原水的配置
阿替洛尔(atenolol, C14H22N2O3)购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司, 阿特拉津(atrazine, C8H14ClN5)、磺胺嘧啶(sulfadiazine, C10H10N4O2S)和卡马西平(carbamazepine, C15H12N2O)购于上海麦克林生化科技有限公司.阿替洛尔酸(atenolol acid, C14H21NO4)、羟基阿特拉津(hydroxyatrazine, C8H15N5O)、脱乙基阿特拉津(deethylatrazine, C6H10ClN5)、脱异丙基阿特拉津(deisopropylatrazine, C5H8ClN5)、卡马西平-10, 11-环氧化物(carbamazepine-10, 11-epoxide, C15H12N2O2)、亚氨基芪(iminostilbene, C14H11N)和2-氨基嘧啶(2-aminopyrimidine, C4H5N3)标准品购于天津阿尔塔科技有限公司.选择阿替洛尔、阿特拉津、磺胺嘧啶和卡马西平这4种物质用超纯水配置成初始浓度为20 μg·L-1的微量污染物溶液.
1.4 滤料培养实验
在150 mL锥形瓶中分别加入5.0 g采集的表面附着生物膜的石英砂和锰砂滤料, 并加入50 mL配置的微量污染物溶液.将锥形瓶放置在30℃ 170 r·min-1的摇床中振荡培养, 在2、4、8、18、24和48 h时采集1.0 mL混合液, 经0.45 μm滤头过滤后用于微量污染物降解产物的测定.另外, 将120℃高温灭菌后的石英砂和锰砂滤料作为无微生物作用的对照组同步进行培养.本实验设3个重复.
1.5 微量污染物和中间产物的浓度测定
采用超高效液相色谱串联四级杆质谱联用仪测定(Ultimate 3000 HPLC, Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)微量污染物的浓度.以Hypersil GOLD (2.1 mm×100 mm, particle size 1.8 μm, Thermo Scientific, Bellefonte, USA)为色谱柱, 采用二元梯度体系(流动相A为含0.1%甲酸的超纯水; 流动相B为HPLC级乙腈).在0~12 min内, 流动相B溶剂梯度为5%~95%, 然后在95%上维持15 min.HPLC与TSQ Altis三重四极杆质谱仪(Thermo Scientific, San Jose, CA, USA)的电喷雾电离探针(ESI) 相连接, 在SRM模式下操作.以氮气为保护气体和辅助气体, 以氩气(1.5 mTorr)为碰撞气体, 在喷雾电压为3 800 V(正模式), 毛细管温度为350℃进行操作.水样中目标微量污染物中间产物的的定量方法采用外标法.在每个实验批次中随机抽取样品进行加标回收率实验(加标浓度为5μg·L-1)作为质量控制.相对标准偏差的最大范围在15%以内.
1.6 9个饮用水砂滤池对典型微量污染物的降解途径分析
利用Usearch v10.0.240(-ublast-accel 0.8)将以往本实验室获取的9个饮用水砂滤池的宏基因组序列与微量污染物降解基因/酶参考数据库和16S rRNA基因数据库GraftM v0.13.1[17]分别进行比对, 确定每个滤料样品中微量污染物降解基因和16S rRNA基因的拷贝数.进一步将每个样品中所有与数据库参考序列比对上的序列的长度相加, 然后除以参考序列的长度, 获得每个样品中该降解功能基因的平均拷贝数.通过将每个功能基因的拷贝数除以16S rRNA基因的拷贝数获得其丰度(gene copy numbers per 16S rRNA gene).
2 结果与讨论
2.1 微量污染物降解基因/酶数据库的构建
根据前人的研究, 明确了4种典型微量污染物的微生物降解途径、基因和相关微生物(表 1), 并将参与生物转化过程的基因和酶构建成微量污染物微生物降解基因(酶)参考数据库.其中, 除草剂阿特拉津在环境中的生物降解的途径有两种, 一是在阿特拉津氯水解酶的作用下转化成羟基阿特拉津[18~22], 二是在细胞色素P450的作用下氧化生成脱异丙基阿特拉津和脱乙基阿特拉津[23, 24].微生物对阿替洛尔的去除机制研究报道较少, 目前仅已知阿替洛尔能够被一级酰胺水解后转化成阿替洛尔酸[25].磺胺嘧啶可以被单加氧酶氧化生成2-氨基嘧啶和4-羟基-2-氨基嘧啶[26~28].卡马西平能被Paraburkholderia xenovorans LB400分泌的联苯双加氧酶快速氧化[29].Labrys portucalensis F11在卡马西平为单一碳源时在30 d内可转化95.4%的卡马西平, 氧化生成卡马西平-10, 11-环氧化物和亚氨基芪, 细菌主要通过分泌细胞色素P450参与卡马西平的氧化过程[30].
表 1
(Table 1)
表 1 微量污染物生物降解基因(宿主)、酶和途径
Table 1 Biodegradation genes (their hosts), enzymes, and pathways of selected micropollutants
微量污染物
基因
宿主
酶
降解途径
文献
阿特拉津
atzABCDEF
Pseudomonas sp. strain ADP
阿特拉津氯水解酶
阿特拉津羟基阿特拉津
[18~22]
trzN
Klebsiella variicola strain FH-1
thcB
Rhodococcus spp. NI86/21
细胞色素P450
阿特拉津脱异丙基阿特拉津+脱乙基阿特拉津
[23, 24]
磺胺嘧啶
sadABC
Achromobacter sp. strain D2/D4Microbacterium sp.
FMNH2依赖性单加氧酶
磺胺嘧啶2-氨基嘧啶+4-羟基-2-氨基嘧啶
[26~28]
阿替洛尔
/
Betaproteobacteria sp.
阿替洛尔酰胺水解酶
阿替洛尔阿替洛尔酸
[25]
卡马西平
/
Paraburkholderia xenovorans LB400
联苯双加氧酶
卡马西平顺式-10, 11-二羟基-10, 11-二氢卡马西平+顺式-2, 3-二羟基-2, 3-二氢卡马西平
[29]
/
Labrys portucalensis F11
细胞色素P450
卡马西平卡马西平-10, 11-环氧化物+亚氨基芪
[30]
表 1 微量污染物生物降解基因(宿主)、酶和途径
Table 1 Biodegradation genes (their hosts), enzymes, and pathways of selected micropollutants
2.2 砂滤池中滤料生物膜降解微量污染物潜力
将滤料宏基因组获取的MAGs与参考数据库比对分析发现[图 1(a)], 锰砂滤池和石英砂滤池中都有含atzA基因的微生物, 说明两种砂滤池中的微生物具有分泌阿特拉津氯水解酶的潜力, 能够将阿特拉津转化为羟基阿特拉津.其中锰砂滤池中的生丝微菌科菌株和石英砂滤池中的假单胞菌菌株是主要的潜在阿特拉津降解菌.同时, 砂滤池中也检测到能够分泌细胞色素P450的生丝微菌属与Methylotenera等菌株, 说明阿特拉津在砂滤池中也可能被氧化为脱乙基阿特拉津和脱异丙基阿特拉津.
图 1
Fig. 1
a1. g_Pseudaminobacter, a2. o_Acetobacterales, a3. f_Hyphomicrobiaceae, a4. g_Pseudomonas, a5. f_Dongiaceae, a6. g_Archangium, a7. g_Vitreoscilla, a8. g_Chthoniobacter, a9. g_Sphingobium, a10. g_Pseudomonas, a11. g_Methyloversatilis, a12. g_Methylotenera, a13. g_Hyphomicrobium, a14. g_Piscinibacter, a15. g_Shewanella, b1. g_Pseudomonas, b2. g_Nitrosomonas, b3. g_Piscinibacter, b4. g_Hydrogenophaga, b5. g_Shewanella, b6. f_Rhizobiaceae, b7. f_Hyphomicrobiaceae, b8. g_Vitreoscilla, b9. f_Reyranellaceae, b10. g_Mesorhizobium, b11. g_Methylophilus, b12. g_Methyloversatilis, c1. g_Nitrosomonas, c2. g_Methyloversatilis, c3. g_Novimethylophilus, c4. g_Piscinibacter, c5. g_Sulfuritalea, c6. g_Pseudomonas, c7. g_Hydrogenophaga, c8. g_Thiobacillus, c9. g_Rubrivivax, c10. g_Hyphomicrobium, c11. g_Flavobacterium, c12. f_Hyphomicrobiaceae, c13. f_Burkholderiaceae, c14. f_Gallionellaceae, c15. f_Rhizobiaceae, c16. f_Anderseniellaceae, d1. f_Beijerinckiaceae, d2. f_Bryobacteraceae, d3. f_Sphingomonadaceae, d4. g_Pseudoxanthomonas, d5. g_Hydrogenophaga, d6. f_Hyphomonadaceae
图 1 阿特拉津、阿替洛尔、磺胺嘧啶和卡马西平在砂滤池中的潜在转化途径和潜在降解菌
Fig. 1 Potential transformation pathways of atrazine, atenolol, sulfadiazine, carbamazepine, and associated bacteria in sand filters
两个砂滤池的微生物群落中含有丰富的分泌阿替洛尔酰胺水解酶的微生物[图 1(b)], 其中亚硝化单胞菌属、根瘤菌科、生丝微菌科和根瘤菌属的微生物在锰砂滤池中的相对丰度高于石英砂滤池.
单加氧酶能够参与多种物质的氧化过程, 包括磺胺类抗生素的氧化.两个砂滤池中共检测到16个科/属含有单加氧酶, 其中以锰砂滤料中的亚硝化单胞菌属、产硫酸杆菌属和根瘤菌科的相对丰度较高[图 1(c)].两种滤池中微生物群落分布的差异主要是由于其进水水源不同(地下水与地表水).
卡马西平能在联苯双加氧酶和细胞色素P450酶的作用下被氧化, 具有分泌联苯单加氧酶的能力的微生物在砂滤池中的相对丰度较低(6.14×10-6%~1.66×10-3%), 推测卡马西平在砂滤池中的降解潜力较弱.
2.3 微量污染物的生物降解途径验证
通过高效液相色谱-串联质谱法分析了滤料培养实验中微生物对阿特拉津、阿替洛尔、磺胺嘧啶和卡马西平的降解中间产物, 结果如图 2所示.鉴定到的阿特拉津降解中间产物分别为羟基阿特拉津、脱异丙基阿特拉津、脱乙基阿特拉津和脱乙基脱异丙基阿特拉津[图 2(a)].灭菌后的石英砂和锰砂培养2 h后有羟基阿特拉津生成, 而未灭菌的滤料在培养过程中未发现羟基阿特拉津的产生, 推测其可能被微生物快速利用.同时, 灭菌和未灭菌培养实验都能检测到脱异丙基阿特拉津的生成, 但脱异丙基阿特拉津在4 h后浓度下降, 说明此时脱异丙基阿特拉津开始降解, 48 h后为(0.02±0.02)~(0.20±0.02)μg·L-1.脱乙基阿特拉津的检出浓度较低, 在0~(0.06±0.005)μg·L-1之间, 但它的下一步转化产物脱乙基脱异丙基阿特拉津检出浓度较高, 可达(4.27±0.16)μg·L-1.因此, 阿特拉津在砂滤池的微生物降解主要是依靠氧化作用.
图 2
Fig. 2
(a1)羟基阿特拉津, (a2)脱异丙基阿特拉津, (a3)脱乙基阿特拉津, (a4)脱乙基脱异丙基阿特拉津, (b)阿替洛尔酸, (c) 2-氨基嘧啶, (d1)卡马西平-10, 11-环氧化物, (d2)亚氨基芪
图 2 石英砂和锰砂滤料培养后阿特拉津、阿替洛尔、磺胺嘧啶和卡马西平的转化产物分析
Fig. 2 Analysis of biotransformation products of atrazine, atenolol, sulfadiazine, and carbamazepine after cultivation of biofilmed quartz-sands and manganese-sands
对于阿替洛尔的降解, 结果发现[图 2(b)], 灭菌后的石英砂和锰砂滤料培养后产生的阿替洛尔酸较少且浓度较稳定[2~48 h内石英砂滤料中为(2.10±0.36)~(2.72±0.55)μg·L-1; 锰砂滤料中为(0.46±0.01)~(0.61±0.02)μg·L-1].而未灭菌的石英砂培养后生成的ρ(阿替洛尔酸)较高, 2 h后可达到(9.38±0.87)μg·L-1, 在4 h后浓度开始下降, 48 h后为(0.12±0.01)μg·L-1.锰砂培养后阿替洛尔酸的生成较石英砂慢, 在0~18 h内ρ(阿替洛尔酸)逐渐升高直至(5.63±1.32)μg·L-1, 之后开始下降, 48 h为(1.45±0.67)μg·L-1.这些结果表明微生物降解和转化阿替洛尔酸占主导地位.
灭菌和未灭菌的锰砂和石英砂滤料培养后都能检测到2-氨基嘧啶的产生[图 2(c)], 但灭菌后的滤料中2-氨基嘧啶的浓度明显较未灭菌的高, 且都在2 h后浓度达到稳定, 说明微生物可能利用了2-氨基嘧啶作为生长的碳氮源.
对于卡马西平的降解, 结果发现未灭菌的锰砂培养后卡马西平-10, 11-环氧化物的浓度明显高于灭菌后[图 2(d1)], 且其浓度在未灭菌的锰砂培养中呈上升趋势, 与灭菌后的锰砂培养趋势明显不同, 说明微生物主导了卡马西平转化为卡马西平-10, 11-环氧化物的过程.未灭菌的石英砂培养后8 h内未检测到卡马西平-10, 11-环氧化物的生成, 但灭菌后的石英砂中有检出, 推测可能是由于微生物将生成的卡马西平-10, 11-环氧化物进一步转化为其它产物.结果同时发现灭菌后的锰砂和石英砂培养中亚氨基芪的浓度高于未灭菌[图 2(d2)], 这可能是滤料中的微生物将亚氨基芪进一步转化.由于没有顺式-10, 11-二羟基-10, 11-二氢卡马西平和顺式-2, 3-二羟基-2, 3-二氢卡马西平的标准品, 故未能鉴定卡马西平在联苯双加氧酶作用下的转化途径.
2.4 不同水厂砂滤池对微量污染物的降解途径解析
为了研究饮用水砂滤池中微量污染物降解途径的特征, 将本实验室前期在全国范围内9座饮用水厂快速砂滤池的宏基因组测序样品与4种微量污染物生物降解基因/酶数据库进行比对分析.结果发现砂滤池微生物组中含有丰富的酰胺水解酶、单加氧酶和细胞色素P450, 说明饮用水砂滤池都具有降解典型微量污染物的潜力(图 3).但分泌阿特拉津氯水解酶的atzAB基因的丰度较低, 推测砂滤池微生物对阿特拉津的水解作用贡献较小[图 3(a)].
图 3
Fig. 3
1.atzA, 2.atzB, 3.atzD, 4.thcB, 5.阿替洛尔酰胺水解酶, 6.单加氧酶, 7.联苯双加氧酶, 8.细胞色素P450
图 3 9个饮用水厂砂滤池对4种微量污染物的降解潜力与途径分析
Fig. 3 Biodegradation potentials and pathways of four micropollutants by the sand filters in nine drinking water treatment plants
3 结论
(1) 依据以往文献报道和现有核酸数据库, 构建了4种微量污染物微生物降解基因(酶)参考数据库.
(2) 通过滤料宏基因组序列与参考数据库比对分析, 发现锰砂滤池生丝微菌科菌株和石英砂滤池中的假单胞菌菌株具有将阿特拉津转化的潜力; 砂滤池含多种分泌阿替洛尔酰胺水解酶的微生物, 如亚硝化单胞菌属与生丝微菌属; 在滤池中广泛存在单、双加氧酶和细胞色素P450, 能将阿特拉津、磺胺嘧啶和卡马西平氧化.
(3) 滤料培养实验确定了砂滤池中4种典型微量污染物的降解途径, 分别为阿特拉津转化为羟基阿特拉津、脱异丙基阿特拉津、脱乙基阿特拉津和脱乙基脱异丙基阿特拉津; 阿替洛尔转化为阿替洛尔酸; 磺胺嘧啶被氧化成2-氨基嘧啶; 卡马西平被氧化成卡马西平-10, 11-环氧化物和亚氨基芪.
(4) 将全国范围内9座饮用水厂快速砂滤池的宏基因组测序样品与参考数据库进行比对分析, 发现砂滤池微生物组中含有丰富的酰胺水解酶、单加氧酶和细胞色素P450, 说明饮用水砂滤池普遍具有降解典型微量污染物的潜力.